انتاج نباتات خالية من الامراض باستخدام تقنيات زراعة الانسجة النباتية
من اهم الاهداف الرئيسة للزراعة النسيجية هو انتاج نباتات خالية من الامراض، ثم الاكثار السريع لهذه النباتات الخالية وتضاعفها بأعداد كبيرة، لان ذلك يؤدي الى تقليل مخاطر انتشار الامراض لما تسببه من انخفاض الانتاج وجودته، فليس من المعقول انتاج ملايين النباتات من اصناف مختلفة والتي قد تحتوي على مسببات مرضية وخاصة الامراض الفيروسية قبل التأكد من خلوها من هذه المسببات المرضية. حيث بتركها يعتبر هذا مساهمة في نشر الامراض وبطرق غير مسبوقة لا تحدث في الطبيعة –(Clark and Bar- Joseph، 1984، Bondok et al.، 1987 and Candresse et al.، 1998)
تنقسم المسببات المرضية عموما الى مسببات حية biotic ومسببات غير حية abiotic وتشمل الاولى وهى المسببات الحية الكائنات الدقيقة منها البكتيريا - الفطريات - الفيروسات وكذا الآفات المختلفة مثل الحشرات والنيماتودا اما المسببات غير الحية وهي الظروف الجوية والبيئة غير الملائمة مثل ملوحة التربة والمياه والارتفاع او الانخفاض الشديد لدرجة الحرارة ونقص العناصر المعدنية والعضوية بالتربة وغير ذلك. ونلاحظ في المجموعة الاولى انه يمكن مكافحة الكائنات الحية الدقيقة مثل البكتيريا والمجموعات الشبيهة مثل الركتسيا والميكوبلازما وغيرها باستخدام كيماويات مناسبة مثل مجموعة المضادات الحيوية وكذلك الفطريات المختلفة، حيث تقاوم بمبيدات الفطريات المختلفة حسب نوع الفطر الغازي للنبات وايضا تستخدم المكافحة بالمبيدات المتخصصة للحشرات التي تهاجم النباتات .
ولكن في حالة الاصابات الفيروسية فان طبيعة الاصابة الفيروسية تستلزم ارتباط الفيروس الشديد بالتركيب الخلوي حيث يوجد غالبا في السيتوبلازم او مرتبط بالنواة بالخلية وهذا ما يعكس صعوبة مقاومته وجميع المواد المستخدمة في علاج هذه الخلايا من الاصابة تستخدم فقط في كبح جماح تضاعف الجزئيات الفيروسية اي تثبيط الفيروس وليس القضاء عليه.
اول من اشار الى امكان انتاج نباتات خالية من الامراض الفيروسية هما الباحثان (1952 ، (Morel and Martin حيث قاما باستخدام المرستيم القمي لنبات الداليا المصابة بفيروس الموزيك لإنتاج نباتات خالية من هذا الفيروس.
يتكون الفيروس اساسا من حمض نووي سواء كان RNA وهو في معظم الفيروسات النباتية وايضا قد يكون DNA كما في معظم الفيروسات التي تصيب الحيوان وهذا لا يمنع من ان هناك بعض فيروسات نباتية تحتوي على DNA والعكس صحيح. ويحاط هذا الحمض النووي لحمايته بغلاف بروتيني يطلق عليه Coat protein.
ويقوم الفيروس بعدوى النباتات بطرق مختلفة الا انه يجب ان يدخل الفيروس عن طريق جرح دقيق في الخلايا والذى قد يحدث عن طريق احتكاك الاوراق او تكسر في شعيرات النبات او جرح عن طريق الحشرات او اثناء خروج الجذور الثانوية او غير ذلك.
وتتم العدوي كما ذكر بعدة طرق وهي:
۱- النقل الميكانيكي للفيروس
الفيروسات النباتية ليس لها القدرة على عدوى النبات الا عن طريق الجروح وهذا على العكس من الفيروسات الحيوانية التي لها طرق اخرى لعدوى الحيوان او الانسان وقد يفسر ذلك لان الفيروسات النباتية ليس لها القدرة على افراز انزيمات تهضم الجدار الخلوي للخلية النباتية الذي يتكون من السيليلوز وهو جدار صلب وعلى العكس ايضا من بعض الفطريات التي يمكن ان تدخل عن طريق الثغور في النبات او حتى عن طريق الضغط على جدار الخلايا النباتية او افراز انزيمات تسهل الدخول الى الخلايا.
٢- النقل الحشري
ويتم انتقال الفيروس خلال منطقة الالتحام بين الاصل والطعم او العكس عن طريق فتحات البلازمودزماتا التي تربط بين الخلايا النباتية، وهذه الفتحات كافية لمرور جزيئات الفيروس من خلية الى اخرى.
المناطق المرستيمية في النبات:
في حالة الاصابة الفيروسية للنبات وحيث ان الفيروس ينتشر في جميع اجزاء النبات فيما عدا المناطق المرستيمية او القمم النامية فهذه الحقيقة يمكن تفسيرها بعدة نظريات:
1- تعتمد هذه النظرية على ان جزيئات الفيروس تنتقل من الخلايا المصابة الى الخلايا السليمة المجاورة وان سرعة نمو الخلايا في المناطق المرستيمية اسرع من دخول جزيئات الفيروس لتلك الخلايا وبالتالي تكون منطقة خالية من الاصابة الفيروسية.
بعض العلماء مثل "Morel" يعتقد ان الفيروس لا ينفذ الى داخل الخلايا اثناء الانقسام (الخلايا المرستيمية) وعند فصل المرستيم النامي او القمة المرستيمية وحدها meristematic domeيؤدي ذلك الى عدم وجود الفيروسات وهذا التفسير يشابه التفسير الخاص بتأثير المعالجة الحرارية في اخلاء النسيج من الفيروس حيث ان درجات الحرارة المستخدمة تؤدي الى الاسراع في النمو الخضري وانقسام الخلايا السريع في مناطق النمو مما يؤدي الى الحد من التكاثر او تحرك الفيروس وعدم امكانه من الانتقال الى الاجزاء التي نمت حديثا.
2- يعتقد ان المنطقة المرستيمية تحتوي على معدل عال من منظمات النمو growth regulators مما يؤدي الى تثبيط تضاعف الفيروس في هذه المنطقة ومن ناحية اخرى الاسراع في نمو الخلايا حيث تكون منطقة خالية من الفيروس.
3- في المراحل الاولى من تكشف القمة النامية فان الخلايا في هذه المنطقة تفتقر الى تكون كامل للممرات بين الخلايا النباتية والتي يطلق عليها بلازمودزماتا وهذه الممرات الطبيعية تساعد في انتقال جزيئات الفيروس بالسرعة الملائمة لغزو الخلايا القمية المرستيمية.
4- في المزارع التي يتكون بها كالوس لا تتكون كل الخيوط السيتوبلازمية والتي تصل الخلايا ببعضها البعض "البلازمودزماتا" بطريقة صحيحة وهذا يؤدي الى تثبيط انتقال الفيروس من خلية الى اخرى مما ينتج عنه كالوسا خاليا من الفيروس.
5- هناك اراء تعتقد انه خلال مرحلة عدم النشاط والتي تعقب عادة عملية قطع الجزء النباتي ووضعه على البيئة المغذية يحدث اضطراب بنشاط البروتين الفيروسي وكذلك الحامض النووي مما قد يؤدي الى التأثير على تضاعف الفيروس (Stace-Smith، 1985)
وأيا كان التفسير فان علماء زراعة الانسجة يجب ان يهتموا بوجود الفيروس في النباتات التي يتم اكثارها بالملايين وتنتقل من دولة الى اخرى. ان الالاف بل الملايين من النباتات من الممكن انتاجها وفق اي نظام اكثار من نظم زراعة الانسجة ولكن من جهة اخري، فان الهدف من انتاج نباتات خالية من الامراض هو انتاج اولا اعداد قليلة من النباتات خالية تماما من المسببات المرضية مع المحافظة على المظهر الخارجي والتركيب الوراثي للصنف ومراعاة عدم حدوث اي طفرات خلال هذه الطريقة مع اختبارها بطرق الكشف المرضي الدقيقة ثم الخطوة التالية هي الاكثار المعملي الدقيق لهذه النباتات.
ان مصطلح النباتات الخالية من الامراض pathogen- free او الخالية من الفيروس virus-free ينتشر حاليا استعماله سواء على المستوى التجاري او العلمي الى حد ما. غير انه هنالك بعض التساؤلات حول هذا المصطلح اذ انه قد يعنى ان النباتات خالية تماما من جميع الامراض والفيروسات الا انه في الواقع ان هذه النباتات تكون خالية من تلك الامراض التي تم الكشف عنها بالطرق المعروفة. وعلى هذا فانه ينبغي من حيث الدقة استخدام مصطلح pathogen-testedاو .virus – tested وعلى العموم فان نظم الاكثار المستخدمة تجاريا هدفها الاقلال او ازالة الامراض المنتشرة والاكثر اهمية والتي تؤثر على الصنف النباتي في منطقة معينة.
وهنا يجب ان نوضح ان النباتات الناتجة والخالية من الامراض ليست كما يزعم ويعتقد البعض تكون مقاومة للأمراض بمعنى اخر انه اذا زرعت في بيئة بها مصادر التلوث يمكن ان يحدث لها اصابات وتختلف شدة الاصابة حسب مصدر الاصابة وتوافر طرق الانتقال لهذه الامراض.
ان معظم الفيروسات وبعض البكتيريا والفيروسات دائما ما تنتقل عن التكاثر الخضري للنباتات عن طريق العقل – الشتلات – الكرمات – الابصال – التطعيم ونادرا ما تنتقل عن طريق البذور. والاصابة الفيروسية على وجه الخصوص يمكن ان تسبب انخفاضا في الانتاجية للنباتات المصابة هذا بالإضافة الى خفض في جودة المنتج النباتي من الثمار وغيرها. ولذلك فان من الاهمية الكبرى استخدام النباتات الخالية من الفيروس كبداية للإكثار الخضري للنباتات الاقتصادية الهامة (1999 ،Grout)
ان احد الاهداف الرئيسة الهامة لمزارع الانسجة النباتية هو انتاج نباتات خالية من الامراض الفيروسية وكذلك الاكثار السريع للنباتات وتضاعف اعدادها، ومن هنا تبرز اهمية انتاج نباتات خالية من الامراض الفيروسية وذلك للأسباب الاتية:
1- تسبب الامراض انخفاض الانتاج والجودة وبالتالي يؤدي ذلك لانخفاض الانتاجية لمعظم المحاصيل الزراعية، وباستخدام تكنيك مزارع الانسجة يمكن تقليل الاصابات الفيروسية، وبالتالي زياده الانتاج.
٢- تقليل مخاطر انتشار الامراض والاصابات الفيروسية حيث ان وجود نباتات مصابة في الحقل يمثل مصدرا للإصابة بينما استخدام مزارع الانسجة الخالية من الامراض يقلل من تفشى الامراض.
3- ان استخدام نباتات خالية من الامراض يحافظ على البيئة بطريقة غير مباشرة حيث يقلل من استخدام المبيدات الكيميائية لمقاومة الحشرات الناقلة للفيروس بل ايضا ينعكس ايجابيا على صحة المزارع والمستهلك في ان واحد.
4- يفضل في بعض الاحيان استخدام مزارع الانسجة في تخزين المادة النباتية كمصدر وراثي germplasm تحت ظروف درجة الحرارة المنخفضة او البيئات خاصة في بنك الجينات gene bank وايضا يتم تبادل مثل هذه المصادر الوراثية بين الدول بأمان ونظرا لان معظم النباتات البرية تكون مقاومة للأمراض وبالتالي يمكن تخزين هذه النباتات ثم استخدامها في برامج انتاج الاصناف المقاومة للأمراض اما عن طريق وسائل الوراثة التقليدية او تقنية نقل الجينات باستخدام الهندسة الوراثية.
5- يسهم استخدام نباتات زراعة الانسجة الخالية من المسببات المرضية في الحد من انتشار النيماتودا في الاراضي الجديدة لخلو الشتلات من النيماتودا بالجذور.
6- تعتبر النباتات الناتجة عن زراعة الانسجة مصدرا جيدا للاستخدام في الزراعات العضوية ويمكن ادراجها ضمن برامج المكافحة المتكاملة للآفات.
7- يمكن بسهوله تبادل ونقل النباتات الخالية من الامراض في اوعيه الزراعة in vitro خلال الحجر الزراعي بين الدول المختلفة.
الطرق المستخدمة للحصول على نباتات خالية من الامراض
1- زراعة القمة المرستيمية او القمة النامية meristem tip or shoot tip culture""
يستخدم جزء صغير جدا (0.1-0.3 مم) كمنفصل نباتي لإنتاج نباتات خالية من الفيروس بدون اي معاملات اخرى (Nasr El Din et al، 1978 and Thrope، 1981 )
ان انتاج نباتات خالية من الامراض (1967 ،Grout، 1999 and Kassanis) عن طريق الزراعة النسيجية يمر بعدة مراحل، تبدا بمرحلة البداية والهدف منها الحصول على مزرعة معقمة خالية من التلوث ويكون الجزء النباتي حيا لم يمت نتيجة عمليات التعقيم. ثم مرحلة التضاعف وتهدف هذه المرحلة الى الزيادة العددية السريعة للنباتات التي تكونت في المرحلة الاولى وهي النباتات الخالية من الامراض، ولتشجيع تكوين الافرع والنموات الجانبية تفصل الافرع المكونة الجديدة وتنقل منفردة في وسط غذائي جديد والعامل المحدد لنجاح هذه المرحلة هي منظمات النمو وخاصة النسبة بين السيتوكينين والاوكسين بالإضافة الى مكونات الوسط الغذائي من املاح معدنية متزنة ومتكاملة ومناسبة للنمو ثم يلي ذلك مرحلة تكوين المجموع الجذري حيث يتم تجهيز النباتات المناسبة من مرحلة التضاعف للنقل الى وسط غذائي مناسب لتكوين الجذور وفي هذه الحالة يضاف الاوكسين للوسط الغذائي وكذلك تزاد الاضاءة في بعض الاحيان لاقلمة النبات في صوبات مجهزة لذلك وهي المرحلة الرابعة والاخيرة لإنتاج نباتات خالية من الامراض والتي يجب اجراء الكشف الفيروسي عليها بالطرق الحديثة (مثل تكنيك ELISA) من البداية حتى النهاية.
هناك عدة اساليب للحصول على نباتات خالية من الفيروس منها تكوين الكالوس من الجزء النباتي او زراعة القمة المرستيمية بمفردها او بعد المعاملة الحرارية او الكيميائية.
1- تكوين الكالوس من الجزء النباتي: لقد وجد العلماء المشتغلون بزراعة الانسجة ان مزارع الكالوس تعطي في النهاية نباتات خالية من الفيروسات حتى اذا كان الجزء النباتي المنزرع محتويا على الفيروس، ولا تعتبر هذه الطريقة عملية حيث ان نسبة النباتات الخالية تصل الى 50 ٪ حيث لوحظ على النباتات المتكشفة عن الكالوس ظهور اعراض فيروسية مثل التبرقش الناتج من فيروس موزيك الدخان "TMV".
2- زراعة القمة المرستيمية مصاحبة للمعاملة الحرارية: وقد يستخدم مع هذا التكنيك معاملات حرارية حيث تتعرض النباتات لدرجة حرارة من 32-40م بمتوسط 37 م لمدة تتراوح من 6-8 اسابيع.
3- زراعة القمة المرستيمية مصاحبة للمعاملة الكيميائية: وفي بعض الاحيان الاخرى يستخدم مع القمة المرستيمية معاملات كيميائية تضاف للوسط الغذائي مثل مادة الثيويوراسيل ومادة الفيرازول بهدف الحصول على نباتات خالية من الفيروس ولقد استخدم ذلك على نباتات البطاطس والموز والقرنفل والاراولا.
4- وفي الموالح والتفاح استخدم طريقة التطعيم المعملي الدقيق بهدف الحصول على نباتات خالية من الفيروسات حيث تزال القمة النامية لنباتات الاصل ويوضع فيها القمة المرستيمية بحجم صغير جدا ويوضع الطعم في الاصل واما ان يكون ملاصقا للكامبيوم او على شكل حرف T المقلوب في الساق.
وللحصول على نباتات خالية من الفيروس يجب معرفة حجم المنفصل النباتي ونوع الفيروس والعلاقة بين الفيروس والعائل.
ولقد حصل العالمان "Morel and Martin" عام 1952 علي نباتات قرنفل خالية من الفيروس وذلك بزراعة القمة المرستيمية. ومنذ ذلك الوقت وتستخدم القمة المرستيمية لإنتاج النباتات الخالية من الفيروس. وفي الاكثار باستخدام مزارع الانسجة استخدمت القمة النامية وهي تحتوي على القمة المرستيمية بالإضافة الى زوج او زوجين من الاوراق الاولية وجزء من الساق السفلية كما استخدمت القمة المرستيمية لإنتاج نباتات عنب خالية من الفيروس. ولقد قدم عديد من العلماء من عام ۱۹۷۸ حتي ۱۹۸۲ مجموعة من الابحاث القيمة في مجال استخدام القمة المرستيمية في الزراعة وكذلك القمة النامية(Barlass and Skene، 1978)
ان الاصابة الفيروسية والتي يطلق عليها على وجه العموم اصابة جهازية فهذا لا يعني ان الفيروس يتوزع بالتساوي في جميع اجزاء النبات المختلفة ولا يعني ايضا انه يصيب جميع خلايا النبات. وهنا نشأت نظرية خلو بعض اجزاء النبات من الاصابة بالفيروس بالرغم من وجود الفيروس بالنبات بصفة عامة كما ان هناك انواعا من الفيروسات التي ترتبط بنوع النسيج فنجد مثلا ان معظم الفيروسات التي تسبب اعراض موزيك على الاوراق يكون تركيزها اعلى في نسيج الورقة (الميزوفيل) بينما فيروس مثل التفاف الاوراق في البطاطس PLRV يتركز في اوعية اللحاء بالنبات.
عند استخدام المرستيم القمي meristem tip culture لأول مرة لإنتاج نباتات خالية من الفيروس كان الاعتقاد السائد لدى عديد من الباحثين ان الناتج من المفترض خلوه من الفيروس لان الفيروس من المعتقد انه لا يغزو الخلايا المرستيمية في البرعم على وجه الاطلاق والجدول التالي يوضح ان هناك علاقه بين نوع الفيروس والعائل النباتي (1977. Mori).
جدول يوضح العلاقة ما بين نوع الفيروس والعائل النباتي وحجم المرستيم للحصول على نباتات خالية من الفيروس
2- المعاملة الحرارية وزراعة المرستيم
يجب الفصل اولا بين استخدام المعالجة الحرارية بصورة مفردة للتخلص او لمكافحة الامراض واستخدامها قبل استخدام طريقة القمم المرستيمية خلال زراعة الانسجة (Nyland and Goheen، 1969).
وقد يستخدم مع زراعة الانسجة معاملات حرارية حيث تعرض النباتات لدرجة حرارة من 32-40 م بمتوسط 37 م وبهذه الطريقة يمكن ازالة حوالي 50٪ من الفيروسات التي تصيب النباتات. ولقد لاحظ الباحثون ان الفيروسات الخيطية والعصوية اكثر مقاومة للحرارة من الفيروسات الكروية. ويفضل ان يكون المنفصل النباتي صغيرا جدا حتى تكون النباتات خالية من الفيروس. ولكن يعاب على هذه الطريقة كثرة عدد النباتات المفقودة من هذه المعاملة وتأثير درجات الحرارة يؤدي الى تقليل الفيروسات وقد يعمل على ازالتها وتفسير ذلك غير معروف تماما.
ولقد اجرى بعض الباحثين تجربة على نباتات البطاطس (2001 ،Faccioli) وذلك بتعريضها للمعاملات الحرارية حيث بدأت من ٢٢ م ورفعت درجة الحرارة تدريجيا درجتان يومين حتى وصلت الى 37م. وزرعت النباتات بالقمه المرستيمية وبعد نموها تم اختبارها للفيروسات كل اربعة اسابيع. واستنتج من هذا البحث ان المعاملة الحرارية هامة جدا لإنتاج نباتات خالية من الامراض (1988 ،Griffiths and Jack)
وعلى سبيل المثال ان تعريض شتلات الفراولة (الشليك) في الصوبات المجهزة لدرجة حرارة من 38-40 م لمدة تتراوح بين 4–6 اسابيع بصفة مستمرة ويتبع ذلك استئصال المرستيم القمي للمدادات الحديثة المتكونة في ظروف الحرارة العالية حيث لا يتعدى المرستيم 0.3 مم فقط باستخدام الميكروسكوب الضوئي تحت شروط التعقيم الكاملة قد ادى الى الحصول على نباتات خالية من الامراض (1961 ،Quak) الا انه يجب ملاحظة فقد عدد كبير من هذه النباتات بسبب التعرض للحرارة المرتفعة.
وبموجب برنامج الكشف عن الامراض التي تصيب الفراولة منها البكتيرية والفيروسات يتم استبعاد ما هو مصاب، اما النباتات التي لم تظهر عليها اية اعراض للإصابة او كانت سلبية للاختبارات يتم وضعها في صوبات متحكم فيها حيث تستخدم كأمهات يتم الاكثار منها عن طريق المدادات (تكاثر خضري) مع المحافظة على عدم تعرضها للإصابة سواء كانت عن طريق الحشرات الناقلة للأمراض او الانتقال الميكانيكي وغير ذلك من طرق نقل الامراض المختلفة. او يمكن استخدامها كأمهات مختبرة يتم الاكثار المعملي لها عن طريق الاكثار الدقيق micropropagation مره اخري.
تعتبر المعاملة الحرارية طريقة ناجحة في تثبيط بعض الفيروسات والتأثير على معدل التضاعف داخل الخلايا النباتية الا انه قد يبدو ان تأثير المعاملة الحرارية يحدث بنجاح في حالة الفيروسات الكروية isometric Viruses كذلك الامراض الناشئة من الاصابة بالميكوبلازما mycoplasma ولكن من ناحية اخري فان حقيقة ان المعاملات الحرارية قد تكون غير مؤثرة فقد ترجع الى ان النبات نفسه حساس للحرارة الى حد كبير او انها ترجع الى الفيروس نفسه ومدى حساسيته للحرارة المرتفعة او قد تكون لأسباب غير معروفة وهذا لا يعنى التوصية بعدم استخدام الطريقة بل تحديد درجة الحرارة المناسبة للتخلص من الفيروس وفي نفس الوقت المحافظة على النبات وعدم الاضرار به.
ان درجة الحرارة وطول مدة المعاملة يجب ان يتم اختيارها بناء على احتمال بقاء Survive النبات تحت تأثير هذه الحرارة المرتفعة بينما يتم تثبيط جزئيات الفيروس الى الحد الذى يؤدي الى الحصول على نباتات خالية من الفيروس.
ان المعاملة الحرارية قد اثبتت نجاحها في اشجار الفاكهة وبعض النباتات مثل قصب السكر والكسافا وهي تستخدم كطريقة روتينية في انتاج نباتات خالية من الامراض الجهازية ويقصد بها الموجودة داخل النبات ويصعب مقاومتها بالمبيدات الكيماوية المعتادة. في حالة الاشجار الخشبية من الملاحظ ان البراعم الجانبية فقط وليس جميع الاشجار او الشتلات المعرضة للحرارة هي التي تكون خالية من الفيروس وهذا يتضح حين يتم اخذ البراعم والتطعيم على شتلات بذرية rootStock والحصول على شتلات خالية من الفيروس.
وغالبا ما تعامل هذه الاشجار او الشتلات المصابة لمدة ٢٠–40 يوما وربما يفضل لعدة شهور تحت درجة حرارة 37-38 م ثابتة خلال المعاملة او في بعض الاحيان لفترات متقطعة. هذه الطريقة ينتج عنها نسبة عالية من النباتات الخالية من الفيروس كما تذكر عديد من المراجع (Faccioli، 2001، Griffiths and Jack، 1988، Jha and. Ghosh، 2005)
لزيادة الفرصة لإنتاج نباتات خالية من الفيروس وخاصة في الحالات الصعبة وكذلك في حالة وجود اكثر من اصابة فيروسية في نفس النبات وهي غالبا ما تعطي بداية جيدة لاستخدام زراعة المرستيم وتعطى فرصة لاستخدام مرستيم كبير الى حد ما وهذا يعنى انخفاض تركيز الفيروس او ان المنطقة المرستيمية الخالية من الفيروس قد زادت.
فترة المعاملة الحرارية 35 – 38 م ) ولمدة 5 – 10 اسابيع استخدمت هذه الطريقة في اقصاء الفيروسات من البطاطس والكريزنثم والقرنفل والفراولة وعلى سبيل المثال فقد امكن تخزين درنات البطاطس في درجة حرارة 37 – 38 م لمدة شهر واحد قبل البدء بزراعة المرستيمات ومن الممكن ان تكون المعاملة الحرارية تعمل على اقصاء المسببات المرضية سواء كانت معروفة او غير معروفة.
جدول يوضح العوائل النباتية التي امكن التخلص من الفيروس الذي يصيبها باستخدام المعاملة الحرارية وزراعة الانسجة
ولكن المعاملات الحرارية لها بعض العيوب منها :
أ- تشويه ساق النبات.
ب- اختلاف حجم الاوراق.
جـ- سقوط الاوراق قبل اكتمال نضجها.
د- التأثير علي التركيب الدقيق للخلايا (تأثير على الشبكة الاندوبلازمية، الميتوكوندريا وكذلك الليبوسوم). والنتيجة تتحطم تراكيب الغشاء وكل هذه التغيرات تؤثر على اكثار الفيروس وتمثيله ويكون هذا مصاحبا للتغيرات في الخلية ويقلل انتشار ريبوسومات الخلية مما جعل العلماء يعتقدون ان انخفاض اكثار الفيروس اثناء المعاملة الحرارية يرجع الى قلة المنافسة بين "RNA" الخاص بالفيروس و RNA الخاص بالخلية والمسئول عن تخليق البروتين (sward and Hallam، 1977)
ونستنتج مما سبق ان استخدام المعاملة الحرارية مع المنفصل النباتي الصغير في مزارع الانسجة النباتية هو الوسيلة الاكثر نجاحا للحصول على نباتات خالية من الفيروس ولكن درجة الحرارة تؤثر على حيوية الانسجة مما يؤدي الى موتها ولذا فان هذه الطريقة محدودة الاستخدام والمنفعة للنباتات التي لا تتحمل الحرارة العالية.
نظرا لان المعاملة الحرارية قد تؤثر على النباتات فانه يوصي ان يتم اختيار النباتات القوية لتحمل المعاملة ويتم اختيار النموات الجديدة ويؤخذ منها المرستيمات او تفصل هذه النموات ويعاد زراعتها كعقل مرة اخرى وتكرر العملية وذلك بغرض الحصول على قمة نامية خالية من الفيروس وهذا يساعد على استخدام مرستيمات اكبر حجما وفرصة اكبر في النمو في مزارع الانسجة والحصول على نتائج ايجابية.
2- المعاملة الحرارية لتثبيط الفيروس (38 درجة مئوية ).
3- الكشف عن الفيروس (بالتطعيم او سيرولوجيا).
4- عزل القمة النامية.
5- الاكثار المعملي.
6- الاقلمه في الصوبات.
7- الاكثار الحقلي.
8- التخزين المبرد للشتلات.
9- الاكثار الحقلي التجاري.
المعاملات الكيميائية
وبالإضافة الى ما سبق فانه يمكن الحد من انتشار الفيروسات باستخدام المواد المعوقة لتكاثر الفيروسات "anti-viral agent" مثل هذه الكيماويات يمكن ان توقف التضاعف للفيروس في الانسجة المصابة ومن المفترض عند وقف التضاعف مع استمرار عمل الانزيمات الخاصة بتكسير جزيئات الفيروس قد يؤدي ذلك الى القضاء على الفيروس.
DeFazio et al 1980، Griffiths and Jack، 1988، Dawson and Lozoya-Sladana، 1984
ومن امثال هذه الكيماويات 2thiouracil"،"malachite green"" التي استخدمت بنجاح في الصوبات الزجاجية للحد من انتشار الامراض الفيروسية وذلك على النحو التالي: حيث ان هذه المواد تثبط تصنيع الحمض النووي او ان ترتبط بالحمض النووي مما يعوق تضاعف الفيروس.
وكذلك استخدمت مادة virazole (ribavirin) ومادة Adenine Vidarabine (arabinoside) للحد من انتشار بعض الامراض الفيروسية ولقد درس العالم "1981 "Simpkins et al واخرون التأثير الكيميائي لمركبات الريبافارين "ribavirin" والسيتوكينين" "cytokinin وبنزيميدازول ""benzamidazole2 هيدروكسيل بنزيل بنزيميدازول"Hydroxybenzyl benzimidazole" وذلك لدراسة تأثير هذه المركبات على الفيروس المسبب لتبرقش الخيار "CMV" ووجد ان استخدام مادة الريبافارين "Ribavirin" لها بعض التأثيرات في خفض الاصابة بالفيروس وكان تفسيرهم لذلك ان دور هذا المركب واضح في تثبيط تخليق الفيروس بالإضافة ان لهذا المركب تأثيرا في تنشيط نمو الخلايا النباتية وذلك مثل مادة السيتوكينين "Cytokinin" الذي يسرع من نمو الخلايا الخضرية ويقلل من نمو المجموع الجذري. اذا نمت الخلية في البيئة المغذية بمعدل اسرع من تضاعف الفيروس بداخلها فأنها ستنتج خليه سليمة وخالية من الفيروس (Sidwell et al. 1972).
اشار العالم 1977 .Shepard ان مركب Virazole يقضى على فيروس X في البطاطس في افرع الدخان المزروعة في البيئة واخرون وجدوا ان تركيز 50-۱۰۰ملليجرام / لتر من هذه المادة يمكن ان تقضى على فيروس CMV كذلك فيروس El-Fiki et al PVX) 1992)
قيم كل من 1991، Chen and Sherwoodاستخدام القمة النامية والمعاملة الحرارية والكيماوية في اقصاء فيروس التبرقش في الفول السوداني واكد على اهميه هذه المعاملات.
التطعيم معمليا بالقمة النامية Shoot tip grafting wall
تستخدم طريقة زراعة القمة المرستيمية بحجم ملائم في كثير من النباتات العشبية حيث يمكن الحصول على نباتات خالية من الفيروس بهذه الطريقة Murashige1974، Faccioli and Marani1998 الا انه من الصعب تطبيق هذه الطريقة في بعض الاشجار الخشبية والفاكهة مثل الموالح والافوكادو، وعلى هذا فيتم اللجوء الى تطعيم القمة النامية الخالية من الفيروس على بادرات بذرية من نفس الاصناف وهي خالية من الفيروس حيث لا ينتقل الفيروس من خلال البذور لهذه الاصناف ويتم هذا في المعمل In vitro.
بدأت طريقة التطعيم بالقمة المرستيمية او النامية معمليا عام ١٩٧٢ واستخدمت للنباتات الخشبية التي لا تعطي مجموعا جذريا بسهولة، ولقد وجد ان نسبة نجاح النباتات الخشبية التي تطعم معمليا تتراوح من 5-40 ٪ حيث ان هذا التكنيك صعب التنفيذ فلقد وجد بالنسبة للموالح انه من الضروري استخدام هذا التكنيك حيث توضع القمة المرستيمية للطعم في اصناف الاصل الموجودة والمزروعة معمليا حيث تزال القمة للأصل ويوضع فيهم القمة المرستيمية او النامية ويلاحظ ان الاصل يكون عبارة عن شتلة زرعت معمليا تحت ظروف التعقيم وخالية من الامراض حيث تزال قمة الاصل ويوضع فيه واحد او اكثر من القمة المرستيمية ويوضع الطعم في الاصل اما ان يكون ملاصقا للكامبيوم او على شكل حرف "T" المقلوب في الساق او على شكل حرف "I".
ويتوقف نجاح التطعيم المعملي الدقيق على وضع القمة النامية المفصولة في نبات الاصل سواء كان التطعيم فوق القمة الفوق فلقية او خلال "T" والطريقة الاخيرة اصبحت طريقة روتينية.
وفي بعض الحالات يكون المطلوب خلو النباتات من فيروس واحد فقط كناتج نهائي، وبعد التأكد من خلو النباتات من الفيروس يتم اكثاره بعد اسابيع او اشهر على حسب نوع النبات. ومن اكثر النباتات التي يستخدم فيها هذا التكنيك هي الموالح والتفاح. ففي الموالح قدّم العالم "1975 .Navarro et al" بحثا لتحسين نسبة نجاح التطعيم المعملي حيث تم تطعيم القمة النامية الصغيرة (1.5mm) من موالح مصابة بالفيروس على اصل مزروع معمليا "Shoot tip grafts". ولقد وجد ان نسبة نجاح التطعيم المعملي بواسطة القمة النامية اذا نما الاصل في الظلام (37.5 ٪) مقارنة بالإضاءة (2.7٪) وعمر الشتلة المثلى اسبوعان. و من الشاكل التي تواجه هذه الطرية تكوين الكالوس، وكذلك مشكلة التلون نتيجة اكسدة المواد الفينولية. ولقد وجد ان التطعيم المعملي الدقيق لا يتأثر بوجود الاوراق الفلقية ومع ذلك فأنها تشجع تكوين الافرع الجانبية. ويزيد نجاح التطعيم بزيادة حجم القمم النامية ولكن القمة المرستيمية الصغيرة مرجّح خلوها من الفيروس. ومادة التطعيم من النباتات الناتجة من المعمل تكون احسن وافضل من تلك الناتجة من الحقل او الصوبة لأنها ليست مرتبطة بموسم معين وذلك طبقا للأبحاث التي اجراها (1975 .Navarro et al).
وقد لوحظ ان زيادة نسبة السكر في البيئة حتى تحتوي على 7.5٪ يشجع نجاح التطعيم المعملي، وكذلك عدد اوراق الطعم وحجم وعدد الجذور العرضية الجديدة وتصل نسبة نجاح التطعيم الى 30-50 ٪ وفي بعض الاحيان تصل الى 90٪ لبعض الاصول القابلة للاتحاد مع الطعوم.
وتعتبر هذه الطريقة ممتازة لإنتاج نباتات خالية من الامراض الفيروسية في الموالح. فلقد وجد ان ٦٦٪ من شتلات البرتقال والجريب فروت المطعمة بهذه الطريقة خالية من فيروس "Stubborn" للموالح، 39٪ للبرتقال ابو سرة كانت خالية من فيروس "Psorosis virus" وكذلك، ۷۸٪ من البرتقال والجريب فروت والليمون كانت خالية من "Exocorts Virioid" ولقد وجد ان من ۸۰ الي ۱۰۰٪ من نباتات الموالح خالية من فيروس Triste وذلك بالتطعيم بالقمة النامية طبقا للأبحاث التي اجراها et al.، 1975 Navarro .
ولقد استخدم "(1980) Huang and Millikan" هذا التكنيك لتقليل الاصابة بفيروس stem grooving (SGV) في صنف التفاح جريفيز وطعمت عليه صنف جولدن ديليش وقطعات القمم النامية الجانبية العليا والسفلى وبعد اسبوع واحد ظهرت انسجة الطعم والتئم مكان الطعم وبعد 6 اسابيع من التطعيم وجد ان الفرع يحتوي على 4 – 6 اوراق ثم نقلت النباتات الى الاصص.
ويتوقف نجاح التطعيم على حجم الطعم وتتراوح النسبة من 15 –62٪. وتزداد نسبة نجاح التطعيم الى 70٪ عند جمع الطعوم من الحقل في اوائل الربيع وتنخفض في الصيف الى 10 ٪ ولقد تفوق تطعيم اصل التفاح للسويقة الجنينية العليا فوق الفلقات من 23-65٪. وصناعة زراعة الانسجة النباتية ان صح هذا التعبير يجب ان تبدا بنباتات خالية من الامراض النباتية ومعها شهادات تدل على ذلك ،كل نبات نحصل عليه في الانبوبة يجب ان يتم اختباره للأمراض بواسطة الاختبارات السيرولوجية او عملية العدوي الصناعية او الميكروسكوب الالكتروني وطرق اخرى منها اختبار PCR التي تعتمد على الحمض النووي.
وتتلخص الطريقة بزراعة بذور الموالح على سبيل المثال بعد تعقيمها باستخدام الصوديوم هيبوكلوريد على بيئة معقمة من الاملاح المستخدمة في بيئة MS دون اضافات اخرى ويعتبر هذا هو الاصل للتطعيم ثم الحصول على القمم النامية اللازمة للتطعيم من النموات الحديثة سواء من الاشجار او الصوبات ثم يتم التعقيم بالمعمل لهذه النموات بطول 3 سم وهي مصدر للطعوم.
وتجري عملية التطعيم بإزالة decapitate قمة البادرة النامية في الانبوب ونزع الفلقات ثم تفصل قمة نامية طول ٢ مم تحت شروط التعقيم وتوضع على سطح قمة البادرة الاصلي او يعمل قطع على هيئة حرف T مقلوب وتوضع القمة داخل هذا الحرف (الشكل التالي). يجب ان نلاحظ ان هذه العملية تحتاج الى دقة وتدريب في العمل.
شكل يبين التطعيم حرف T في الموالح
يلاحظ ان كلما زاد حجم الطعم تزداد نسبة نجاح التطعيم ولكن من جهة اخرى تقل نسبة الخلو من الفيروس وعلى هذا يجب ان يراعى حجم القمة المرستيمية التي قد لا تتعدي ۲مم وهي افضل حجم للتطعيم (1974 ،Murashige ) الا انه ايضا يلاحظ ان نسبة نجاح التطعيم باستخدام هذه الطريقة تتراوح بين 10 – 40 ٪ على اكثر تقدير وعلى العموم يمكن استخدام هذه الطريقة لإنقاذ بعض الاصناف المصابة بالفيروس بشدة من خلال برامج التربية للمساعدة في سرعة الحصول على امهات خالية من الاصابات الفيروسية.
يوضح الشكل التالي الطرق المختلفة للحصول على نباتات خالية من الفيروس من نباتات مصابة باستخدام اكثر من طريقة سواء كانت مفردة او الجمع بين اكثر من اسلوب وفي جميع الحالات يجب ان يكون هناك اختبار دقيق للتأكد عمليا من اقصاء الفيروس من النباتات الفردية المتحصل عليها وبعد ذلك يمكن تطبيق طرق الاكثار المعملي الدقيق للحصول على نوية سليمة من نباتات هذا الصنف.
شكل يوضح انتاج نباتات خالية من الفيروس باستخدام معاملات مختلفة
انتاج نباتات خالية من الاصابة الفطرية والبكتيرية
ليس فقط من الممكن انتاج نباتات خالية من الاصابة الفيروسية بل ايضا يمكن التخلص من الاصابات البكتيرية والفطرية باستخدام تقنية زراعة المرستيم القمي وانقاذ بعض الاصناف النباتية (1987 ،Pierik) التي تكون فيها الاصابات جهازية اي داخل الانسجة ومن الصعب استخدام المبيدات الفطرية او البكتيرية لمقاومتها حيث ان التكاثر الخضري باستخدام الطرق التقليدية سواء بالعقل او الدرنات وغيرها يسمح بإعادة انتاج نباتات مصابة والجدول التالي يوضح بعض النباتات التي امكن اخلاؤها من البكتيريا والفطريات.
جدول يبين استخدام تقنية زراعة المرستيم القمي لإنتاج نباتات خالية من الاصابة الفطرية والبكتيرية
الاختبارات الفيروسية Virus Index
بالرغم من الاعتقاد السائد ان القمة المرستيمية للنبات يجب ان تكون خالية من الفيروس ولذلك تستخدم في انتاج نباتات خالية من الفيروس فانه ليس هناك اي سبب او عذر لعدم استخدام طرق الفحص الفيروسي للتأكد من خلو هذه النباتات الناتجة حيث انه لا يوجد برهان كافي الى حد اليقين للتسليم بخلوها من الفيروس على وجه الاطلاق. وفي حالة اكثار النباتات بطرق زراعة الانسجة وعدم خضوعها للفحص الفيروسي قد يؤدي ذلك الى عواقب وخيمة.
وعلى المستوى التجاري فان اتجاه انتاج نباتات خالية من الامراض لم يلق اقبالا كبيرا في البداية من اصحاب المشاتل التجارية وبقى هذا محصورا في نطاق ضيق وقد يعود ذلك لعدة اسباب منها:
1- قد تبدو الاختبارات المرضية غير مفهومة للبعض وقد ينظر اليها المستثمر باعتبارها مكملا غير ضروري لعملية الانتاج.
2- عدم توافر الخبرة من ناحية الامراض وكيفية تجنبها والحاجة الى خبير علمي لمتابعة المراحل المختلفة في الانتاج.
3- عدم وجود قناعة كافية لأهمية الكشف المرضى.
4- النظر على ان الكشف عن الامراض من الامور التي تؤدي الى زيادة التكلفة لعملية الانتاج.
5- الاعتقاد السائد ان مجرد اجراء عمليات الاكثار المعملي كفيل بإنتاج نباتات خالية من الامراض.
وفي هذا الصدد يوجد عديد من طرق الفحص للفيروس المتوفرة حاليا منها:
1- النباتات الكاشفة Indicator Plant
تعتمد الطريقة على استخدام بعض العوائل النباتية والتي تؤدي اصابتها بالفيروس الى ظهور اعراض مميزة على هذه النباتات يمكن رؤيتها بوضوح ويطلق عليها النباتات الكشافة او كاشفة host range ويتم زراعتها في صوبات متحكم فيها. ولإجراء الاختبار يتم باستخلاص عصارة النبات المراد الكشف عنه ثم دلك (مسح) اوراق النبات الكاشف لهذه العصارة مع استخدام بعض الكربورندم للمساعدة على عمل جروح دقيقة لدخول الفيروس ان وجد الى داخل الخلية دون الاضرار. وتبدا ظهور علامات الاصابة الفيروسية على النباتات على هيئة اما اعراض جهازية مثل التبرقش او اعراض بقع محلية على الاوراق تبعا لنوع الفيروس والعائل النباتي ودرجات الحرارة وغير ذلك من الظروف المحيطة Maramorosh and Koprowski، 1967).)
وبالرغم من بساطة الاختبار فهناك عوامل كثيرة يجب وضعها في الاعتبار حيث تحتاج الطريقة الى صوبات مجهزة لنمو نباتات العوائل الكاشفة التي عادة ما تكون متنوعة جدا للكشف على اكبر عدد من الفيروسات المختلفة، كما تحتاج هذه النباتات الى رعاية خلال فترة النمو وحتى ملاحظة الاعراض فضلا على عدد من العمالة المدربة والتكلفة العالية وبالإضافة الى ذلك فهناك بعض الفيروسات لا تنتقل عن طريقة الحقن الميكانيكي بالعصير. واهم العيوب هو غالبا ما تحتاج الى وقت طويل حتى ظهور الاعراض المميزة وهذا ما لا يلائم ويخالف متطلبات سرعة الكشف الفيروسي لاستخدامها في زراعة الانسجة.
شكل يوضح الحقن الميكانيكي للفيروس علي العوائل النباتية
1- طريقه الحقن بالعصير 2- مظهر البقع الميتة على نبات Gomphrena globosa
وهذه العيوب السابق ذكرها تحدث ايضا حين يستخدم النقل الحشري من النباتات المراد اختبارها الى العوائل النباتية في الصوبة ومما يزيد من الصعوبة ضرورة تربية انواع من الحشرات الناقلة للفيروس بصورة خالية من الفيروس التي تنقله بما يحمله من اعباء بتوفير اماكن ملائمة لتربية واكثار هذه الحشرات وتوفير عمالة مدربة وماهرة في ذلك ويزداد الامر صعوبة ايضا اذا كانت هذه الفيروسات المراد الكشف عنها تنتقل عن طريق التطعيم حيث تطعم هذه النباتات على اصول كاشفة وتحتاج الى مدة طويلة لإنجاح التطعيم ثم ظهور الاعراض، مما قد يعرض اجراءات زراعة الانسجة الى التأخير وضياع الميزة النسبية في الاكثار السريع للنباتات.
2- الميكروسكوب الالكتروني
شكل يبين الميكروسكوب الالكتروني وشكل جزيئات الفيروس الكروية
وفي حالة التركيز المنخفض لجزيئات الفيروس في العينات قد يصعب اكتشافه ويحتاج الى اخذ مزيد من العينات كما ان هناك مشكلة في جزيئات الفيروس الكروية التي قد تتشابه مع الريبوسومات الموجودة اصلا في الخلايا النباتية العادية غير المصابة مما يصعب عملية الفحص والحكم على العينة كما انه لا يمكن الكشف باستخدام هذا الجهاز للإصابات بالفيرويد وهو المسبب المرضي المشابه للفيروس وهو لا يحتوي على الغلاف البروتيني المميز للفيروسات الحقيقية.
3- الكشف السيرولوجي (اختبار ELISA)
تعتبر طريقة (Enzyme-linked Immunosorbent assay) ELISA احدى طرق التشخيص السيرولوجية للأمراض وهي تعتبر لذلك اهم هذه الطرق المستخدمة الان في تعريف الفيروسات النباتية وقد وجد Clark & Adams سنة 1977 ان طريقة ELISA باستخدام الاطباق تعتبر طريقة دقيقة وكافية لتحديد واختبار وجود الفيروسات النباتية في جميع المحاصيل للكشف عن الفيروسات في الاجزاء النباتية او العوائل الحشرية وفي البذور والنباتات المتكاثرة خضريا وقد كان لتطوير هذه الطريقة وطرق تقنية اخرى للتدقيق وسرعة الكشف عن عدد كبير من العينات النباتية في فترة قصيرة والوصول الى تكلفة قليلة Hamoton et al، 1990، Abou Zeid et al، 1990 Mahmoud et al1996، ، Baldauf et al.2006
ومنذ هذا الوقت اصبحت هذه الطريقة واسعة الانتشار حتى انه يتم تطبيقها على النطاق التجاري لعديد من الفيروسات والبكتيريا والفطريات. ويمتاز هذا الاختبار بسهولة اجرائه والحساسية الشديدة والدقة كما انه سريع النتائج بالمقارنة بالطرق الاخرى للكشف عن الفيروس. و يجب التأكيد علي ان هذا الاختبار شائع الاستخدام ويمكن اجراؤه بسهولة وتتوافر المواد اللازمة لإجرائه خلال شركات متخصصة مما يسهل استخدامه مصاحبا لإجراءات وخطوات زراعة الانسجة. وتنقسم الطريقة الى طريقة مباشرة واخرى غير مباشرة الا ان النتائج تكون متطابقة والاختلاف في الطريقة غير المباشرة هو اضافة انزيم اضافي للتفاعل
Clark and Bar-Joseph، 1984) ).
ويعتمد في الكشف على ان الفيروس يتكون من حمض نووي محاط بغلاف بروتيني مميز. ولذلك فانه ينتج اجساما مضادة في احد الحيوانات ذات الدم الحار وتستخدم هذه الاجسام المضادة بعد فصلها من الحيوان وحين تتفاعل مع مستخلص النبات تعطي نتيجة ايجابية في حالة وجود الفيروس في مستخلص النبات. ولكي يمكن رؤية هذا التفاعل وتقديره كميا حيث يربط بأنزيم يعطي تفاعلا لونيا واضحا (انظر الشكلين في الاسفل). مما هو جدير بالذكر ان هذا الاختبار لا يجدي في الكشف عن الفيرويد وهو مسبب مرضى لا يملك غطاء بروتينيا.
قبل الاستطراد في هذه الطريقة يجب تعريف بعض المصطلحات التي تستخدم مثل Antigen-Antibodies - Antiserum.
اولا: Antigen الانتيجين
تعرف الانتيجينات على انها جزيئات تحتوي على بروتين او عديدة التسكر Polysaccharides وهذه الجزيئات تعتبر اجساما غريبة اذا ما تم حقن انواع من الفقاريات بها وتشمل هذه الانتيجينات تحضيرات الفيروس النباتي او الحيواني والفطريات وجراثيم البكتيريا وغير ذلك. هذا الانتيجين له قدرة على تنشيط الجهاز المناعي للحيوان المحقون به لإنتاج نوع معين من البروتينات يطلق عليها Antibodies التي تكون في سيرم هذا الحيوان وفي هذه الحالة يطلق على السيرم Antiserum (سيرام مضاد) هذا الاخير له القدرة على التفاعل او الاتحاد مع هذا الانتيجين.
ثانيا: الاجسام المضادة Antibodies
وهي اجسام مضادة تنتج في دم الحيوانات الفقارية نتيجة لوجود انتيجين غريب في دم هذه الحيوانات وهي نوع من البروتينات عالية التخصص تعرف باسم Immunoglobulins او IgGوهذا البروتين قادر على الاتحاد بالانتيجين الخاص به.
ثالثا: السيرم المضاد Antiserums
وهو ما يطلق عليه السيرام المضاد للفيروسات النباتية في هذه الحالة. ويمكن انتاجه في عديد من الحيوانات ولكن يعتبر الارنب هو الحيوان الرئيس لعدة اعتبارات منها انتاجه الجيد للسيرام المضاد للفيروسات النباتية كما يسهل التعامل مع الحيوان ولكن هذا لا يمنع من استخدام حيوانات اخرى مثل الفئران وخنازير غينيا والدجاج وغير ذلك. ويتم فصل IgG من الدم بطرق تنقية معينة خلال ترشيح بواسطة فلاتر خاصة.
فوائد استخدام طريقة ELISA
أ- من اكثر الاختبارات حساسية لتشخيص معظم الفيروسات والتي تتضمن فيروسات البطاطس مثل PLRV ، PVA التي تكون بتركيز منخفض في العائل كذلك الحال في فيروس تورد الموز bunchy top virus)).
ب- يحتاج الاختبار الى كمية قليلة جدا من السيرام المضاد بالمقارنة بغيره من الطرق السيرولوجية الاخرى.
ج) يمكن اجراء عدد كبير من العينات في وقت قصير وقد يعاب على هذا الاختبار كثرة الخطوات المتبعة للحصول على النتيجة وقد امكن حاليا اختصار في وقت التحضين واستخدام اطباق سابقة التجهيز بالسيرم مما يؤكد ان هذا الاختبار يمكن تعديله واتباعه في برامج انتاج وتحسين التقاوي او الطرق الخاصة بالتربية لإنتاج اصناف مقاومة.
والشكل التالي يمثل الخطوات الاساسية المتبعة في طريقة ال ELISA وهي الطريقة المباشرة "Direct double antibody sandwich method"
شكل يوضح خطوات التفاعل في الطريقة المباشرة Direct ELISA
اولا: تغطية الاطباق بالسيرم المضاد المتخصص
وهي الخطوة الاولى ونقم فيها بتغطية جميع الثقوب الموجودة في الطبق البلاستيك عدد ٩٦ ثقبا بالمصل المضاد المتخصص وهو بروتين شديد التخصص IgG ويحتاج هذا الى تحضير محلول منظم buffer وهذا المحلول يمكن الاحتفاظ به في الثلاجة على درجة 4 م لمدة شهر واحد ويتركب من المواد التالية:
Coating Buffer
1.59 g Na CO3
2.9 g Na HCO3
- يخفف السيرم المضاد والمنقى IgG باستخدام المحلول المنظم السابق ويعمل فيه تخفيفات 10000/ 1000.1/ 1000.1/1 حسب تركيز السيرم والاجسام المضادة به.
- يضاف ۱۰۰-۲۰۰ ميكرون بواسطة ماصة دقيقة من التخفيفات السابق الاشارة لها وذلك في كل ثقب من الطبق. ومن المعروف انه محلول المنظم PBS-tween بإضافة مادة PVP ٢ % له.
ثانيا: طحن واضافة العينات النباتية المحتوية على الفيروس
وهذه الخطوة تشمل طحن العينات في هذا المحلول المنظم بتخفيف 10/ 1 او 20 / 1 وذلك حسب تركيز الفيروس في نسيج العينة حيث ان الكمية الاقل من المحلول المنظم تعطى اعلى تركيزا من الفيروس - الطريقة العملية البسيطة هي الضغط على العينات في اكياس بلاستيك صغيرة بعد اضافة المحلول المنظم لها باستخدام انبوبة اختبار بالضغط عليها من الخارج ثم جمع العصير، كما يمكن ايضا استخدام جهاز طحن كهربائي ذي سرعات عالية بعد ذلك تملا الثقوب بالعينات باستخدام ماصة نظيفة لكل ثقب حتى لا يتم حدوث تلوث من عينة الى اخرى ويراعى ايضا وجود عينات سليمة في هذا الاختبار كما يجب ان يكون هناك عينات مصابة في نفس الطبق. ويكفي ثقب واحد لكل عينة الا ان بعض المعامل تفضل تكرار العينة مرتين، ويجب وضع العينات حسب خطة معينة ويجب تسجيل ذلك في جداول خاصة ليسهل الرجوع اليها، بعد ذلك تحضن الاطباق على درجة حرارة 4 م لليوم التالي او على درجة حرارة 37 م لمدة 4 – 6 ساعات بعد ذلك تغسل الاطباق كما سبق باستخدام محلول PBS-Tween .
ثالثا: اضافة المصل المضاد المرتبط بالأنزيم
بالرغم من ان هناك انزيمات مختلفة يمكن استخدامها لربط المصل المضاد الا ان alkaline phosphatase، peroxidase يعطي نتائج جيدة مع الفيروسات النباتية. يخفف الانزيم باستخدام محلول منظم PBS-Tween ويتم ذكر التخفيف الملائم على العبوة، بعد ذلك يضاف السيرام المعلم بالأنزيم الذي تم تخفيفه الى ثقوب الطبق ثم يحضن الطبق لمدة ساعتين على درجة حرارة الغرفة او على درجة حرارة 37م. بعد انتهاء مدة التحضين يغسل الطبق بالطريقة السابقة ثلاث مرات. ومن المعروف ان السيرم المرتبط بالأنزيم سوف يرتبط بجزيئات الفيروس الموجودة في العينة ان وجدت والمرتبطة بدورها بجدار الثقوب.
رابعا: اضافة مادة التفاعل Substrate
وهي عبارة عن مادة تتفاعل فقط مع الانزيم اذا وجد ولهذا التفاعل يستخدم المحلول
المنظم التالي:
Substrate Buffer
97ml Diethanolamine
800 ml H2O
pH 9.8 with HCl
الذي يذاب به مادة التفاعل Substrate التي تكون علي هيئه عصي في نهاية ورقة او على هيئه حبوب او مسحوق ويجب الاحتراس الشديد عند وزن هذه المادة او اذابتها لأنها سهلة التأكسد واذا تحول لونها الى اللون الاحمر فلا تستخدم وهي تحضر طازجة ويراعى عدم تعرضها الى الضوء لسهوله تاكسدها وتستخدم بتركيز 0.6-0.8 لكل مللي جرام من المحلول المنظم. يضاف 100 ميكرولتر لكل ثقب في الطبق ثم تحضن الاطباق في درجة حرارة الغرفة في الظلام لمده 10 – 30 دقيقة حسب نوع الفيروس المستخدم وربما تصل الى ساعة كاملة في بعض فيروسات الموالح.
وتتفاعل مادة التفاعل مع الثقوب التي بها عينات مصابة ويتحول لونها الى اللون الاصفر في حالة انزيم phosphataseواللون الاصفر المحمر في حالة peroxidase وتتناسب كثافة اللون طرديا مع تركيز الفيروس في العينة وتسجل النتائج اما بالعين المجردة ويمكن قراءة هذه النتيجة بواسطة جهاز ELISA Reader حيث يحول الجهاز اللون وكثافته الى ارقام يمكن مقارنتها بالعينات المختلفة.
وهو جهاز خاص لقياس اللون على طول موجي 405 في حالة الانزيم الاول او 490 في حالة استخدام الانزيم الثاني. ويلاحظ انه يجب اضافة عينة تحتوي على الفيروس في كل طبق للمقارنة وايضا اضافة المحلول المنظم Buffer المستخدم في اذابة المكونات كما ذكر.
تنتج عديد من الشركات نظم كشف Kits تجاريا لفحص العينات النباتية للفيروسات المختلفة باستخدام ELISA وانزيم Peroxidase وتتلخص الطريقة لفحص فيروسات البطاطس فيما يلى:
1- تحضر العينات النباتية بطحنها في محلول منظم ثم اضافة ۱۰۰ ميكرولتر لكل ثقب من الطبق ثم التحضين على درجة حرارة ٢٠-٢٥ م او في الثلاجة لليوم التالي.
2- يحضر السيرم المعلم بالأنزيم Enzyme conjugate
3- يغسل الطبق ثلاث مرات على الاقل باستخدام PBS-tween المرفق مع kits.
4- اضفEnzyme conjugate (lµ100) ويحضن على درجة حرارة الغرفة لمدة ساعتين.
5- حضر محلول substrate.
6- اغسل الطبق ثلاث مرات بواسطة المحلول المنظم السابق PBS-tween.
7- اضف substrate
8- حضن لمدة حسب نوع الفيروس، لاحظ الجدول التالي:
جدول يبين العلاقة ما بين نوع الفيروس ووقت التحضين
10- قراءة النتائج وتسجيلها.
شكل احدي الكواشف التجارية ELISA Kits للكشف عن الفيروس في النباتات والنتائج المتحصل عليها
تحليل نتائج اختبارات ELISA
في حالة اخذ نتائج العينات بالعين المجردة فانه يمكن تقسيم التفاعل الى ما يلى:
1- لا يوجد تفاعل (-)no reaction
2- تفاعل خفيف + mild reaction
3- تفاعل متوسط ++ moderate reaction
4- تفاعل شديد اي تركيز عال +++ high concentration
وعلى هذا فانه يجب ان يكون هناك عينات سليمة في كل طبق ليسهل المقارنة كذلك وجود عينات مصابة من هذا الفيروس في نفس الطبق ويجب القول ان هذه الطريقة غير دقيقة للحكم علي العينات فيها عدا ان يكون الفيروس ذا تركيز عال في العينات.
ولذلك يراعى استخدام جهاز ال ELISA لأنه يعطي قيما رقمية لكل من العينات السليمة healthy والمصابة infected. وعلى هذا نأخذ قيمة العينة السليمة (المقارنة) healthy بعد ضربها في ٢ اي مضاعفتها ثم نعتبر قيم العينات الاعلى من هذه القيمة مصابة.
وهناك طريقة اكثر دقة باستخدام المعادلة التالية مع مراعاة عمل مكررات:
(قيمه المصاب (-) قيمة السليم (+) الانحراف المعياري × ضعف قيمة السليم ).
ولتقيلي تكلفة الاختبار يمكن تجميع العينات ذات الاعداد الكبيرة في مجموعات كل يحتوي على 10 نباتات واعتبارها عينة واحدة واختبارها سويا اي باعتبارها اختبارا واحدا وفي حالة النتائج الموجبة اي يوجد اصابة يتم استبعاد هذه العينة المجمعة كليا والتي تحتوي على 10 نباتات او اعادة فحص هذه العينة كل نبات على حدة ثم استبعاد ما هو مصاب هذا وفي حالة الاعداد الصغيرة يتم فحص كل العينات المفردة. مع الاخذ في الاعتبار ان ما يخدم هدف زراعة الانسجة من اجراء الاختبار التأكد من عدم وجود الاصابة الفيروسية في العينات وليس تحديد نوع الفيروس.
المشاكل الفنية التي تظهر باستخدام ELISA
1- عدم تكون لون في الطبق:
فيكون الاحتمال نسيان احدى الخطوات او استخدام محلول منظم مختلف او الانزيم والسيرم غير فعال فيراعى النظر الى تاريخ الصلاحية او طريقة التخزين وعمل positive في كل طبق واختبار الانزيم لعلاج هذه المشاكل.
2- تكون لون في جميع انحاء الطبق بدون تخصص:
يكون السبب هو ان السيرم غير نقي اي يحتوي على سيرم مضاد لبروتين النبات نفسه او عدم غسل الطبق جيدا او خطا في وضع النبات ولذلك يراعى وجود healthy في الطبق واستخدام سيرم اكثر تخصصا واستخدام Substrate طازج ويغطي الطبق اثناء التحضين.
3- وجود الاصفرار في الاماكن الخطأ:
اما ان يكون الغسيل غير كامل او خطا في وضع وتسجيل العينات او ان هناك محلولا من بعض الثقوب انتقل الى ثقوب اخرى مجاورة وفي هذه الحالة ينصح بالغسيل الجيد او زيادة خطوة للغسيل او استخدام اغطية للطبق مع الحرص في التداول، كما يجب تجفيف الطبق او الحواف بعد الغسيل.
4- ظهور اللون بسرعه جدا:
يكون السبب اما ان الانزيم ذو تركيز عال جدا او ان ال Substrate تركيزها عال وينصح باستخدام انزيم و Substrate ذات تركيز يعطي قراءة 1 على جهاز ELISA في فترة من 30-60 دقيقة على انتيجين قوي في ظروف التحضين المستخدمة.
شكل جهاز ELISA Reader لقراءة نتائج التحليل للعينات وتحويلها الى نتائج رقمية وتخزينها في الحاسوب (الكمبيوتر).
اختبار PCR
تتلخص طريقة الكشف في التركيز على اجزاء اساسية من الحمض النووي للفيروس وهي تمثل قطعا من DNA كما يمكن استخدام cDNA في حالة الفيروسات المحتوية على RNA ثم مضاعفة هذه القطع خلال استخدام بادي متخصص Primers وتوضع في جهاز PCR، ويتم مضاعفة هذه القطع الصغيرة ملايين المرات حيث يسهل الكشف عنها في النباتات حين اختبارها. وتعتبر هذه الطريقة في استخدام جهاز PCR حاليا من الطرق البسيطة وغير المكلفة نسبيا حيث يمكن استخدامها بطريقة روتينية في الوقت الحاضر للكشف عن الامراض وتعريف البكتيريا والفيروسات وغير ذلك من الكائنات الممرضة للنبات.
استخدمت طريقة RT-PCR بنجاح للكشف عن فيروسات النبات وخاصةRNA viruses وايضا العديد من الفيروسات منها فيروس التفاف اوراق البطاطس PLRV وتجعد اوراق العنب GFV ومرض الترستيزا Tristeza في الموالح ، (Nolasco et al 2002) ويمكن ايضا باستخدام هذه الطريقة والاستعانة بجهاز Real time PCR التحديد الكمي لجزيئات الفيروس اي تركيز الفيروس في العينة المختبرة، انظر الشكل التالي. (Jarosva and Kündn 2009).
ذكر الباحثان Gibbs and Mockenzie عام ۱۹۹۷ ان طريقة PCR متخصصة جدا وهي تقنية حساسة كما انها حساسة اكثر من مائة مرة بالمقارنة بالطرق السيرولوجية ومنها ELISA بل ايضا الاف المرات عن حساسية طرق الميكروسكوب الالكتروني واضافا ان هذه الطريقة تحتاج للفحص الى اجزاء صغيرة من النبات والتي تعطي كمية كافية من الحمض النووي اللازم لاختبار ال PCR.
وتعتبر طريقة ال ELISA بالرغم من انها اقل تكلفة الا انها تعتمد في التعريف للكائن المرضي على وجود غطاء بروتيني للكائن، بينما تعتمد طريقة PCR على قطع صغيرة محددة من الحمض النووي يتم مضاعفتها في الجهاز ليسهل الكشف عن الكائن حتي لو كان تركيز هذا الكائن في النبات صغيرا جدا وكما ان ELISA قد تعطي نتائج غير مؤكدة في بعض الاحيان ( 2003. Singh et al ) وخاصة عند استخدام Polyclonal antibodies ومن ناحية اخرى يمكن الكشف عن ال Viroidsوهو شبيه بالفيروس ولا يكون غلافا بروتينيا اعتمادا على الحمض النووي المكون له باستخدام طريقة PCR Condresse et al.، 1998)).
بالرغم من ان طرق PCR يمكن استخدامها في تحديد كمية الفيروس في النبات او حتى تحديد سلالات الفيروس والتفرقة بين هذه السلالات الا ان المطلوب لخدمة مزارع الانسجة هو تحديد وبطريقة دقيقة وحاسمة وبسرعة ملائمة خلو النباتات الناتجة عن زراعة الانسجة من الكائنات الممرضة لأنه سوف يترتب على هذه الطريقة اكثار ملايين النباتات خلال الاكثار الدقيق وهذا قد يؤدي الى نشر الاصابة الفيروسية بدلا من انتاج نباتات خالية من الفيروس او المسببات المرضية الاخرى.
شكل يبين جهاز Real time PCR يستخدم في الكشف عن الفيروس وايضا للكشف عن الاختلافات الوراثية في النباتات الناتجة عن الاكثار الدقيق للتحقق من مطابقة النباتات للأصل
لقد اسهمت البيولوجيا الجزيئية بنصيب وافر في تقدم التقانات الحيوية وعلى راسها زراعة الانسجة النباتية ومن المنتظر ان يكون هناك مزيد من التطبيقات العملية في مجال الكشف الدقيق والسريع عن المسببات المرضية التي تصيب النباتات المختلفة.
المصدر
أ.د تيمور نصر الدين، أ.د. ابراهيم عبد المقصود، د. محمد احمد محمد نجاتي. تقنيات وتطبيقات زراعة الانسجة النباتية. القاهرة. 2014.
ليست هناك تعليقات:
إرسال تعليق